Práctica 2. Determinación cuantitativa de hemoglobina 07/10/2019

OBJETIVO

  • El objetivo de esta práctica es realizar una determinación cuantitativa de hemoglobina en sangre.

FUNDAMENTO

  • La hemoglobina es oxidada por la acción del ferricianuro a metahemoglobina y mediante el cianuro se convierte en cianmetahemoglobina. La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de hemoglobina presenta en la muestra ensayada.
  • La hemoglobina es una proteína que se encuentra en la sangre, le otorga el color rojo y es la encargada de transportar oxígeno por la sangre.
    • Un nivel bajo de hemoglobina puede indicar: anemia primaria, cáncer, embarazo, enfermedades renales o hemorragias.
    • Un nivel alto de hemoglobina puede indicar cardiopatías, deshidratación o estancia en lugares de gran altitud

MATERIALES

  • Pipeta graduada y auxiliar de pipeteado.
  • Micropipeta y puntas de pipeta.
  • Agua destilada.
  • Bote para desechos.
  • Gradilla.
  • Soporte para cubetas.
  • Cubetas de espectrofotometría (vol 1 cm).
  • Tubos de ensayo. 

REACTIVOS

Hemoglobin CAL (utilizado para preparar el patrón)
Hemoglobin 50X (utilizado para preparar el RT)

MUESTRA

Muestra de sangre venosa

APARATOS Y EQUIPOS

Espectrofotómetro (debemos encenderlo unos 15 minutos antes de empezar a utilizarlo)

CÁLCULOS

Necesitamos preparar tres cubetas distintas (blanco, patrón y muestra).
Preparación del reactivo de trabajo

PREPARACIÓN DE REACTIVOS 

  • Preparación del REACTIVO DE TRABAJO (RT).

    • Preparamos 20 mL de RT con: 19,6 mL de agua destilada y 8 gotas de hemoglobin 50X. Estos 20 mL se reparten entre los 5 grupos.

  • BLANCO.

    • El blanco está constituido por 2,5 mL del reactivo de trabajo (RT). 

  • PATRÓN. 

    • El patrón está constituido por 2,5 mL de RT y 10 μL de hemoglobin CAL.

PROCEDIMIENTO

  1. Una vez preparados el blanco y el patrón, debemos preparar la muestra. Se prepara con 2,5 mL del reactivo de trabajo (RT) y 10 μL de la sangre que vayamos a estudiar. Utilizamos sangre de una compañera del año anterior.
    10 μLde sangre
    Muestra preparada
  2. Mezclamos e incubamos durante 3 minutos a temperatura ambiente.
  3. Pasamos la muestra a una cubeta de espectrofotometría y leemos la absorbancia utilizando el espectrofotómetro con una longitud de onda de 540 nm.
    1. Medimos el blanco.

    2. Medimos el patrón.
    3. Medimos la muestra.

       

 RESULTADOS Y OBSERVACIONES

  • La absorbancia del patrón: 1,032A.
  • La absorbancia de la muestra: 0,441A.
  • El resultado obtenido se encuentra fuera de los valores normales, ya que es de 6,41 g/dL de hemoglobina en muestra. Esto puede haberlo provocado algún error durante el procedimiento.

  • ERRORES.

  • El error principal puede haber sido utilizar sangre con un periodo de conservación mayor al recomendado (la recomendación es de máximo 2 meses en nevera). La sangre llevaba 9-10 meses en la nevera.
  • Pueden haberse producido errores durante la preparación de los reactivos, durante el pipeteo, etc.

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